ACQUITY UPLC-ELSD 测定奶粉和牛奶中八种糖的含量

赵淑军

（沃特世科技有限公司 北京实验室 中国）

关键词：超高效液相色谱 ： 奶粉 牛奶 Fructose（果糖） Sorbose（山梨糖） Glucose（葡萄糖） Sucrose（蔗糖） Maltose（麦芽糖） Lactose（乳糖） Maltotriose（麦芽三糖） Maltotetraose（麦芽四糖）

实验方法

1、材料、试剂和仪器

乙腈为色谱纯，三乙胺为优级纯，实验用水为超纯水(18MΩ,TOC 3ppb)，牛乳清蛋白标准品Bα-La 、Bβb-Lg和Bβa-Lg；ACQUITY UPLC®超高效液相色谱系统，Acquity ELSD检测器，FILTER MIXER (425μl,P/N 205000403）

2、色谱条件
液相系统：Waters ACQUITY UPLC®配ACQUITYELSD蒸发光检测器
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide 2.1mm x 100mm，1.7 µm
柱温：35˚C
分析时间 ：18 min
进样量：5ul（样品进样2ul）
流动相：A：水 B：0.2%TEA乙腈溶液;梯度洗脱
弱洗溶剂：乙腈/水=90/10，800ul
强洗溶剂：乙腈/水=10/90，500ul
进样方式：不充满定量环（使用针溢出）
ELSD条件：
增益：500
数据率：10pps
喷雾器模式：冷却
漂移管温度：55℃
气体压力：30psi
实验室试验温度：20℃
实验室试验湿度：45%
工作电源：220V稳定电源
梯度方法见下表：

3、数据处理系统 、数据处理系统

Empower 2

4、前处理方法

称取 2.0 g 奶粉样品或 5ml 液态奶样品，加入 20mL（对于液态奶添加 15ml）1/1 的乙腈水溶液溶解，手摇震荡混匀，然后均质混匀 2 分钟，室温下 8000r/min 离心 15 分钟，取上清液过 0.2um 滤膜；对于某些样品由于糖含量很高，所以过滤后的样品可能需要用乙腈/水=70/30 的溶液稀释一定倍数后，进样检测。

结果与讨论

1、标准配制

八种糖标准分别称取10mg，用1/1的乙腈水定容1ml，然后用乙腈/水=70/30的溶液稀释配制各个浓度的标准品，进行实验。

2、八种糖 UPLC 分离检测色谱图及数据

图 1 八种糖 UPLC 分离检测色谱图

图1是八种糖50ppm混合标准品用UPLC（ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱）分离，ELSD检测的色谱图，按照保留时间顺序分别是：Fructose（果糖）、Sorbose（山梨糖）、Glucose（葡萄糖）、Sucrose（蔗糖）、Maltose（麦芽糖）、Lactose（乳糖）、Maltotriose（麦芽三糖）、Maltotetraose（麦芽四糖）；包括5种单糖和3种多糖。有关数据见下表。

其中较难分离的 Fructose（果糖）和 Sorbose（山梨糖）、Maltose（麦芽糖）和 Lactose（乳糖）均分别达到 1.6、1.5 的分离度。

3、方法的检出限

如图 2 所示，为 5ppm 的混标色谱图，此浓度下按保留时间顺序八种糖的信噪比分别达到 3、5、5、24、6、12、5 和 3，（进样量 10ul）：

可见，八种糖中Fructose（果糖）、Sorbose（山梨糖）、Glucose（葡萄糖）、Maltose（麦芽糖）、Maltotriose（麦芽三糖）和Maltotetraose（麦芽四糖）的检测限为5ppm；此浓度下Lactose（乳糖）可达到定量限，而Sucrose（蔗糖）的定量限可以到达2ppm。

4、方法的线性相关性 、方法的线性相关性

浓度分别为5.000、10.000、20.000、50.000、100.000、150.000 mg/L的八种糖标准品依次进样，进样量均为5µL，外标法定量。以峰面积A的lg值为纵坐标，浓度C的lg值为横坐标进行线性回归，得到8种糖的线性方程、复相关系数和线性曲线图如图3-图10所示，在5.000-150.000 mg/L范围8中糖均具有良好的lg-lg线性关系。

5、实际样品检测结果 、实际样品检测结果

从市场取某一奶粉样品，进行实际提取实验，进样检测，色谱图及结果数据见图11所示，可以看出此样品中含有蔗糖、乳糖、麦芽三糖和麦芽四糖四种糖成分，同时发现蔗糖和乳糖得含量相当高，已经超出检测器的响应范围；因此将此样品稀释 100 倍后再次进样检测，结果数据见图 12。

由图 11 和 12 的数据可以知道此奶粉中含有蔗糖 16.8mg/g、乳糖 140.1 mg/g、麦芽三糖和麦芽四糖的含量分别只有 1.9 mg/g、1.3 mg/g。某液态奶提取后，稀释 100 倍检测结果见图 13。

6、重现性

首先用 50ppm 混合标准 6 次连续重复进样，考察标准品在本方法下的稳定性，见图 14所示重叠色谱图，重复数据见表 3、表 4。

提取奶粉实际样品，由于乳糖含量较高，将其稀释了 100 倍，然后在不同天次连续 3天进样检测，考察本方法对于实际样品天间的重现性情况，如图 15 所示是该实际样品 3 天内 3 次进样的重叠色谱图，有图可见该方法对实际样品在天间具有较好的重现性。

结论：

本方法建立了用Waters UPLC-ELSD系统检测奶粉和牛奶实际样品中Fructose（果糖）、Sorbose（山梨糖）、Glucose（葡萄糖）、Sucrose（蔗糖）、Maltose（麦芽糖）、Lactose（乳糖）、Maltotriose（麦芽三糖）、Maltotetraose（麦芽四糖）8种常见糖的的定量分析方法。方法的检出限为有6种糖达到5μg/g，两外两种糖Sucrose和Lactose在5μg/g下的信噪比可达到24和12。使用ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱和三乙胺流动相体系，8种糖均实现基线分离，可以用于奶粉和牛奶中常见这8种糖的含量测定。
参考文献：

Waters ACQUITY UPLC BEH Amide Columns Care & Use，P/N:715001371